Простой метод окраски. Является одноэтапным и заключается в окраске микропрепарата одним красителем. Используют основные анилиновые красители, такие как, фуксин, генцианвиолет, метиленовый синий в виде водных растворов или пропитанных красителем фильтровальных бумажек, которые помещают на мазок и смачивают водой. Продолжительность окраски составляет 3-5 минут, после чего микропрепарат промывают водой, высушивают и микроскопируют. В препаратах, окрашенных простым методом, можно получить представление о форме, расположении и размерах микробных клеток.
Сложные методы окраски. Сложные (дифференцирующие) методы окраски (по Граму, Цилю-Нильсену и др.) включают последовательное использование нескольких красителей и дополнительных способов обработки препаратов. Эти методы позволяют дифференцировать бактерии в зависимости от строения их структур, чаще всего поверхностных. Например, метод окраски по Граму позволяет дифференцировать бактерии по строению их клеточной стенки: грамположительные (фиолетовые) с толстой и грамотрицательные (красные) бактерии с тонкой клеточной стенкой.
Существуют специальные сложные методы окраски, которые используют для выявления структурных компонентов бактериальной клетки: капсул, цитоплазматических включений, спор, жгутиков.
Механизмы окрасок по Граму и Цилю-Нильсену
Метод Грама. Относится к сложным методам окраски и позволяет дифференцировать грамположительные и грамотрицательные бактерии, что является важным таксономическим признаком. Результат окраски определяется особенностями строения клеточной стенки бактерий. При окраске генцианвиолетом и последующем воздействии раствора Люголя образуется комплексное соединение генцианвиолета и йода с пептидогликаном, которое при дифференциации спиртом удерживается в клетках грамположительных бактерий, имеющий многослойный пептидогликан и вымывается из грамотрицательных бактерий, имеющих тонкий слой пептидогликана. При дополнительной окраске водным раствором фуксина грамотрицательные бактерии приобретают красный цвет.
Таблица 4. Метод Грама
| Этапы окраски | Цвет бактерий |
| 1. На фиксированный мазок поместить фильтровальную бумажку, пропитанную генцианвиолетом, смочить водой, 2-3 минуты | Все бактерии окрашиваются в фиолетовый цвет |
| 2. Снять бумажку, слить с препарата оставшуюся краску и налить раствор Люголя на 1 минуту | Все бактерии остаются фиолетовыми |
| 3. Для дифференцирования нанести на мазок этиловый спирт и обесцветить в течение 30-60 с, промыть водой | Грамположительные бактерии остаются фиолетовыми, грамотрицательные обесцвечиваются |
| 4. Нанести фуксин Пффейфера (водный раствор фуксина) и докрасить 1-2 мин, промыть водой, высушить | Грамположительные остаются фиолетовыми, грамотрицательные окрашиваются в красный цвет |
Метод Циля-Нильсена. Относится к сложным методам окраски и позволяет дифференцировать кислотоустойчивые и некислотоустойчивые бактерии.
Таблица 5. Метод Циля-Нильсена
Кислотоустойчивые бактерии имеют особое строение клеточной стенки, содержащей большое количество сложных липидов (миколовых кислот, восков, глико- и фосфолипидов), что делает эти бактерии кислото-, щелоче- и спиртоустойчивыми. Клеточная стенка этих бактерий плохо воспринимает анилиновые красители и обычные способы окраски. Высокая температура в процессе окраски методом Циля-Нильсена расплавляет липиды, фенол разрыхляет клеточную стенку и краситель проникает внутрь клетки. После остывания препарата липиды вновь затвердевают, прочно удерживая краситель, поэтому кислотоустойчивые бактерии не обесцвечиваются серной кислотой и остаются красными. Некислотоустойчивые бактерии обесцвечиваются и их докрашивают контрастным красителем – метиленовым синим. В основном, метод используется для окраски бактерий, относящихся к роду Mycobacterium (M.leprae, M.tuberculosis, M,bovis и др.)
III. План практической работы
1. Изучить механизм и этапы окраски по Граму, приготовить мазок из смеси бактерий и окрасить по Граму, заполнить таблицу в рабочей тетради.
2. Изучить механизм и этапы окраски по Цилю-Нильсену, приготовить мазок из сапрофитных микобактерий, окрасить по Цилю-Нильсену, заполнить таблицу в рабочей тетради.
3. Сравнить строение прокариотической и эукариотической клетки по ряду признаков, заполнить таблицу в рабочей тетради.
4. Изучить и перечислить в таблице основные таксономические категории на примере C.tetani и T.pallidum или других бактерий.
Окрашивание по Граму широко распространено в микробиологии, так как это один из самых простых способов дифференциации бактерий в зависимости от состава их клеточной стенки. По Граму все бактерии можно разделить на грамположительные (Грам(+)) и грамотрицательные (Грам(-)). Метод окрашивания по Граму был разработан в 1884 году, и с того времени не утратил популярности, хотя и неоднократно модифицировался.
Структура клеточной стенки
Окрашивание по Граму позволяет выявить, к грамположительным или грамотрицательным относится та или иная бактерия. Деление бактерий на Грам(+) и Грам(-) осуществляется в соответствие со строением их клеточной стенки.
Клеточная стенка в наибольшем количестве содержит пептидогликан (муреин) - сложное вещество, в состав которого входят пептапептид и гликан. Гликан состоит из чередующихся остатков N-ацетилглюкозамина и N-ацетилмурамовой кислоты, соединенных друг с другом β-1,4-гликозидными связями. Пептидогликан обеспечивает поддержание формы клетки, осмотическую защиту, а также антигенные функции.
Основные различия грамположительных и грамотрицательных бактерий
У различных бактерий толщина слоя пептидогликана не одинакова. У бактерий, которые относят к грамположительным, она составляет от 15 до 80 нм, в то время как у грамотрицательных - от 2 до 8 нм. В то же время у грамотрицательных бактерий под слоем пептидогликана есть особая структура, которой нет у грамположительных бактерий - периплазматическое пространство. Это пространство заполнено гидролитическими ферментами - β-лактамазой, рибонуклеазой 1, фосфатазой. Именно эти ферменты ответственны за резистентность грамотрицательных бактерий в отношении многих антибиотиков.
Слой пептидогликана Грам(-) бактерий связан с липополисахаридом - антигенной структурой, содержащей эндотоксин. У Грам(+) бактерий похожие функции выполняют тейхоевые кислоты.
У присутствует дополнительная структура - внешняя мембрана.
Суть метода окрашивания
Перед тем как начать окрашивание, готовят мазки исследуемых бактерий. Для этого на предметное стекло капают воду и бактериальной петлей добавляют туда культуру микроорганизмов. Затем, после полного высыхания воды, мазок фиксируют - предметное стекло проносят несколько раз над пламенем горелки. Окрашивание мазков по Граму более эффективно, чем окрашивание живых бактерий - с мертвыми клетками лучше связываются молекулы красителя.
Окрашивание производится в несколько этапов:
Причины различного характера окрашивания
Как было описано выше, при окрашивании бактерий по Граму грамположительные бактерии окрашиваются в сине-фиолетовый цвет, а грамотрицательные - в красный или розовый. Причина дифференциального окрашивания бактерий по этому методу состоит в том, что после попадания в клетку растворимой формы генцианвиолета краситель переходит в нерастворимую йодную форму. Во время обработки бактерии этиловым спиртом под действием этого неполярного растворителя из мембраны экстрагируются липиды. После этого мембрана становится пористой и больше не является существенным препятствием для вымывания красителя. Однако пептидогликан более устойчив к действию неполярных растворителей, в том числе и спирта. Именно он препятствует вымыванию красителя, поэтому бактерии с толстым муреиновым слоем окрашиваются в сине-фиолетовый цвет (грамположительно), и после обработки спиртом свой цвет не меняют.
Тонкий муреиновый слой грамотрицательных бактерий не может удержать в клетке молекулы красителя, поэтому после действия спирта они становятся бесцветными - окрашиваются грамотрицательно.
После воздействия на мазок фуксином при окрашивании по Граму грамположительные бактерии остаются сине-фиолетовыми, а грамотрицательные приобретают розово-красный оттенок.
Примеры Грам(+) и Грам(-) бактерий
К грамотрицательным относятся цианобактерии, серобактерии, железобактерии, хламидии, риккетсии, уксусные бактерии, многие метилобактерии, тионовые бактерии, арсенитобактерии, карбоксидобактерии.
Грамположительными являются бифидобактерии, многие водные бактерии, стрептококки и стафилококки.
Окраска микроорганизмов (крашение микробов) - комплекс методов и приемов для исследования внешнего и внутреннего строения микроорганизмов, метод микробиологической техники, позволяющий различать виды микроорганизмов. Метод широко используют в прикладной бактериологии для определения формы, размеров, строения, локализации, взаимного расположения микробов, структуры их органелл. Без окраски микробы, кроме некоторых грибов, в световой микроскоп практически не видны, вследствие их малой контрастности. После обработки мембраны и/или органеллы микробов приобретают контрастирующую с фоном окраску.
// Общие сведения о методе
Препараты микробов подвергают действию химических реагентов, обычно - красителей, или тетраоксида осмия. В результате физико-химического процесса взаимодействия красителя с химическими соединениями объектов, с целью искусственного придания ему определённой окраски, появляется возможность определить вид микроорганизма, или хотя бы тип его мембраны (см. окраска по Граму).
Способы крашения разделяют на витальный, поствитальный и негативный, последний может быть витальным и поствитальным.
Витальный способ окраски
Для витального (прижизненного) крашения применяют 0,2-0,001 % водные растворы метиленового и толуоидинового синего, нейтральрот и конго красный, которые добавляют в придавленную или висячую капли культуры. Этим способом выявляют спирохеты, простейшие, определяют подвижность бактерий, иммунное набухание капсулы, но использование его требует строгого соблюдения правил, исключающих лабораторное заражение.
Поствитальные способы окраски
Способы крашения фиксированных препаратов (поствитальные) разделяют на простые и сложные. При простых способах красящие растворы фуксина Пфейффера (экспозиция 1-2 мин), щелочного метиленового синего (3-5 мин) наносят на фиксированный препарат, так, чтобы он полностью покрыл мазок, краситель сливают, препарат промывают струйкой воды, встряхивают, высушивают и микроскопируют.
Простые способы позволяют судить о величине, форме, локализации, взаимном расположении отдельных клеток, но с их помощью нельзя установить структуру микробов и часто их дифференцированное отношение к красителям.
Из сложных способов крашения бактерий в основном используют дифференцированный способ Грама, выявление кислотоустойчивости по Цилю - Нельсону, определение волютиновых зёрен по Леффлеру или Нейссеру, дифференцирующий способ Романовского - Гимзы, негативно-позитивный способ определения капсулы по Гинсу - Бурри, выявление спор по Пешкову или Цилю - Нельсону и др.
Для крашения простейших применяют способ Романовского - Гимзы и окраску гематоксилин-эозином.
Грибы исследуют неокрашенными или способами Грама, Циля - Нельсона, Леффлера, Романовского - Гимзы, а также раствором Люголя, лактофуксином и др.
Метод Грама - метод окраски микроорганизмов для исследования, позволяющий дифференцировать бактерии по биохимическим свойствам их клеточной стенки. Предложен в 1884 году датским врачом Г. К. Грамом.
По Граму бактерии окрашивают осно́вными красителями - генциановым или метиловым фиолетовым и др., затем краситель фиксируют раствором йода. При последующем промывании окрашенного препарата спиртом те виды бактерий, которые оказываются прочно окрашенными, называют грамположительными бактериями - в отличие от грамотрицательных (Грам (−)), которые при промывке обесцвечиваются.
// Использование в диагностике
Окраска по Граму имеет большое значение в систематике бактерий, а также для микробиологической диагностики инфекционных заболеваний.
Грамположительны кокковые и спороносные формы бактерий, а также дрожжей, они окрашиваются в иссиня-чёрный (тёмно-синий) цвет.
Грамотрицательны многие неспороносные бактерии, они окрашиваются в красный цвет, ядра клеток приобретают ярко-красный цвет, цитоплазма - розовый или малиновый.
Техника проведения окраски
Окраска по Граму относится к сложному способу окраски, когда на мазок воздействуют двумя красителями, из которых один является основны́м, а другой - дополнительным. Кроме красящих веществ при сложных способах окраски применяют обесцвечивающие вещества: спирт, кислоты и др.
Для окраски по Граму чаще используют красители трифенилметановой группы: генциановый, метиловый фиолетовый или кристаллвиолет. Грамположительные Грам (+) микроорганизмы дают прочное соединение с указанными красителями и йодом. При этом они не обесцвечиваются при воздействии на них спиртом, вследствие чего при дополнительной окраске фуксином Грам (+) микроорганизмы не изменяют первоначально принятый фиолетовый цвет.
Грамотрицательные Грам (−) микроорганизмы образуют с основными красителями и йодом легко разрушающееся под действием спирта соединение. В результате микробы обесцвечиваются, а затем окрашиваются фуксином, приобретая красный цвет.
Подготовка материала для окраски
Исследуемый материал распределяют тонким слоем по поверхности хорошо обезжиренного предметного стекла. Приготовленный мазок высушивают на воздухе и после полного высыхания фиксируют. Гистологические срезы готовят по рутинной методике, фиксируя кусочки тканей в формалине и заливая в парафин.
Фиксация
При фиксировании мазок закрепляется на поверхности предметного стекла, и поэтому при последующей окраске препарата микробные клетки не смываются. Кроме того, убитые микробные клетки окрашиваются лучше, чем живые.
Различают физический способ фиксации, в основу которого положено воздействие высокой температуры на микробную клетку, и химические способы, предусматривающие применение химических средств, вызывающих коагуляцию белков цитоплазмы.
Физический способ фиксации
Предметное стекло с препаратом берут пинцетом или I и II пальцами правой руки за рёбра мазком кверху и плавным движением проводят 2-3 раза над верхней частью пламени горелки. Весь процесс фиксации должен занимать не более 2 с.
Надёжность фиксации проверяют следующим приёмом: свободную от мазка поверхность предметного стекла прикладывают к тыльной поверхности левой кисти. При правильном фиксировании мазка стекло должно быть горячим, но не вызывать ощущения ожога.
Химический способ фиксации
Для фиксации мазков применяют метиловый спирт, ацетон, смесь Никифорова (смесь этилового спирта 96 % и наркозного эфира в соотношении 1:1), жидкость Карнуа (этилового спирта 96 % - 60 %, хлороформа 30 %, ледяной уксусной кислоты 10 %), спирт-формол (40% формалин 5 мл, этиловый спирт 96° - 95 мл). Предметное стекло с высушенным мазком погружают в склянку с фиксирующим веществом на 10-15 минут и затем высушивают на воздухе. Применяется также фиксация в парах 40% формалина в течение нескольких секунд.
Процесс окрашивания мазков
На фиксированный мазок наливают один из осно́вных красителей на 2-3 минуты. Во избежание осадков окрашивают через фильтровальную бумагу.
Сливают краску, аккуратно удаляют фильтровальную бумагу. Мазок заливают раствором Люголя или йодистым раствором по Граму (водный раствор йодида калия и кристаллического йода в соотношении 2:1) на 1-2 минуты до почернения препарата.
Раствор сливают, мазок прополаскивают 96° этиловым спиртом или ацетоном, наливая и сливая его, пока мазок не обесцветится и стекающая жидкость не станет чистой (приблизительно 20-40-60 секунд).
Тщательно промывают стекла в проточной или дистиллированной воде 1-2 мин.
Для выявления грамотрицательной группы бактерий препараты дополнительно окрашивают фуксином или сафранином (2-5 мин).
Промывают в проточной воде и высушивают фильтровальной бумагой.
Техника окраски бактерий в гистологических срезах по Граму-Вейгерту
Депарафинированные срезы доводят до воды.
Окрашивают 20 мин в 1% растворе парарозанилина или основного фуксина в 1 % уксусной кислоте (раствор красителя нагревают до кипения, охлаждают и фильтруют).
Промывают в 3 сменах дистиллированной воды.
Окрашивают 5 мин в 1% кристаллического фиолетового в дистиллированной воде.
Быстро ополаскивают в 1% растворе хлорида натрия.
Обрабатывают 30 с в смеси: 1 часть йода + 2 части йодида калия + 100 частей дистиллированной воды.
Промокают фильтровальной бумагой.
Дифференцируют, нанося на срез смесь равных объемов анилина и ксилола (1 - 2 мл); растворы сливают до тех пор, пока облачка красителя не перестанут отходить от среза.
Проводят через 3 смены ксилола
Заключают в бальзам или любую смолу, растворенную в ксилоле.
Результат: грамположительные бактерии сине-черные, фибрин фиолетовый, ядра красные.
Метод Пешкова применяется для окраски эндоспор бактерий.
Техника окрашивания
Высушенный препарат из культуры грамположительных бактерий фиксируют в жидкости Карнуа в течение 15 минут, затем промывают водой, наливают метиленовый синий по Леффлеру и нагревают до появления паров, кипятят 15-20 минут, после охлаждения препарата промывают и докрашивают 0,5% водным раствором нейтрального красного или фуксина по Пфейферу 30-60 секунд. Высушивают с помощью фильтровальной бумаги и микроскопируют.
Результат окрашивания
В результате зрелые эндоспоры окрашиваются в голубой цвет, молодые - в темно-синий, цитоплазма красная, зерна хроматина окрашиваются в фиолетовый цвет.
Метод окраски по Цилю - Нельсену - метод окраски микроорганизмов для выявления кислотоустойчивых микобактерий (возбудителей туберкулёза, микобактериозов, лепры), актиномицетов и других кислотоустойчивых микроорганизмов. Кислотоустойчивость микроорганизмов обусловлена наличием в их клетках липидов, воска и оксикислот. Такие микроорганизмы плохо окрашиваются разведёнными растворами красителей. Для облегчения проникновения красителя в клетки микроорганизмов нанесённый на препарат феноловый фуксин Циля подогревают над пламенем горелки. Окрашенные микроорганизмы не обесцвечиваются слабыми растворами минеральных кислот и спирта.
Метод назван именами немецких медиков - микробиолога Франца Циля (1857-1926) и патологоанатома Фридриха Нельсена (1854-1898), которые разработали его в 1882-1883 гг.
Этапы окраски
1. Фиксированный мазок покрывают плоской фильтровальной бумагой и наливают на неё феноловый фуксин Циля. Мазок подогревают над пламенем горелки до появления паров, затем отводят для охлаждения и добавляют новую порцию красителя. Подогревание повторяют 2-3 раза. После охлаждения снимают фильтровальную бумагу и промывают препарат водой.
2. Препарат обесцвечивают путем погружения или нанесения на него 5%-го раствора серной кислоты или 3% солянокислого спирта и промывают несколько раз водой.
3. Окрашивают препараты водно-спиртовым раствором метиленового синего 3-5 минут, промывают водой и высушивают.
При окраске по методу Циля - Нельсена кислотоустойчивые бактерии приобретают интенсивно красный цвет, остальная микрофлора окрашивается в светло-синий цвет.
Окраска по Романовскому - Гимзе цитологический метод окраски простейших, бактерий, клеточных структур и тканей различных видов (в том числе крови) при световой микроскопии. Окрашивает ацидофильные образования в различные оттенки красного цвета, базофильные - в цвета от пурпурного до синего.
// Приготовление красителя
Готовый жидкий краситель перед окрашиванием мазков разводят из расчета 1-2 капли красителя на 1 мл дистиллированной воды. Мазки окрашивают 20 - 25 минут при 37 °C во влажной камере (закрытая чашка Петри с увлажнённым фильтром на дне). После окрашивания мазки промывают в проточной воде, сушат на воздухе и исследуют при масляной иммерсии.
Красящую смесь Романовского-Гимзы, которая имеет в основе краску Романовского Райта, в виде порошка (коммерческий краситель) растворяют в смеси равных объемов метилового спирта и глицерина (800 мг красителя на 100 мл растворителя). Краситель растворяется плохо, поэтому лучше его растереть с растворителем в количестве 300 мг на 100 мл, а затем, помешивая, добавлять краситель до получения нужной концентрации. Приготовление красителя часто занимает несколько дней. Важно в качестве растворителей использовать химически чистый метиловый спирт и глицерин, так как примеси ухудшают свойства красителя. Вместо метилового спирта можно применять 100 % этиловый спирт. Приготовленную красящую смесь хранят в сухом прохладном месте в плотно закрытом сосуде.
Методика окраски
Мазки, фиксированные в метиловом спирте, окрашивают раствором (1 мл готовой жидкой краски + 2 мл основного буферного раствора + 47 мл дистиллированной воды) в течение 40-120 мин (продолжительность окрашивания подбирают эмпирически). Пользуются фосфатным буфером, но рН буфера зависит от вида мазка: для мазка костного мозга - 5,8 - 6,0, для мазка крови - 6,4 - 6,5, для выявления простейших - 6,8, малярийного плазмодия - 7,0 - 7,2.
Ополаскивают в дистиллированной воде, высушивают и исследуют при иммерсии.
Результат окраски
Бактерии окрашиваются в фиолетово-красный цвет, цитоплазма клеток - в голубой, ядра - в красный. При окрашивании простейших их цитоплазма приобретает голубой цвет, а ядра - красно-фиолетовый.
Вопрос 5. Простые и сложные методы окраски. Подразделение сложных методов окраски по назначению. Протравы и дифференцирующие вещества. Метод Грама: сущность, этапы окраски, практическое применение.
Ответ: Простой метод окраски является одноэтапным (1 краситель –анилиновые, фуксин, генцианвиолет, метиленовый синий в виде растворов или пропитанных бумажек). Окраска 3-5 минут, промывание, высушивание, микроскопия. Можно получить представление о форме, размерах, расположении (но не о деталях строения).
Сложные
Дифференциальные - позволяющие отличить один вид или группу бактерий от других (по Грамму – характер клеточной стенки, метод Циля-Нильсена - кислотоустойчивые).
Протравы - химические и физические вещества, повышающие окрашиваемость микроорганизмов. Уплотняют цитоплазму и делают окраску более прочной, либо разрыхляют клеточную стенку и способствуют проникновению краски в клетку (раствор Люголя в методе Грама, карболовая кислота в методе Циля-Нильсена)
Дифференцирующие вещества избирательно обесцвечивают одни виды или структуры бактериальных клеток и не обесцвечивают другие
(спирт в методе Грама, серная кислота в методе Циля-Нильсена и Ожешко).
Окраска по Грамму.
|
цель метода |
Выявление грамположительных и грамотрицательных бактерий |
|
основной краситель |
карболовый раствор генцианвиолета |
|
протрава |
раствор Люголя (после окрашивания) |
|
дифференцирующее вещество | |
|
дополнительный краситель |
разбавленный карболовый раствор фуксина |
|
в пламени спиртовки до окрашивания |
|
|
этапы окраски |
Окрасить раствором генцианвиолета 1 мин. (или с бумажкой – 3 мин.); Нанести на мазок раствор Люголя – 1 мин.; Промыть в этаноле 30 сек.; Промыть водой; Окрасить раствором фуксина 1 мин. (или с бумажкой – 5 мин.); Промыть водой; Высушить |
|
сущность метода |
Генцианвиолет образует комплекс с тейхоевыми кислотами в присутствии Люголя, который задерживается многослойным пептидогликаном у грамположительных бактерий. При дополнительной окраске фуксином грамотрицательные бактерии приобретают красный цвет. |
Вопрос 6. Сложные методы окраски, протравы и дифференцирующие вещества. Метод Циля-Нильсена: сущность, этапы окраски, практическое применение.
Ответ: Сложные методы многоэтапные, различные красители, протравы, дифференцирующие вещества. Сложные методы бывают:
Дифференциальные (отличить группы (по Грамму - характер клеточной стенки, метод Циля-Нильсена -кислотоустойчивые).
Предназначенные для выявления различных структур (споры- Ожешки, включения волютина-Нейссера, капсула- Бурри-Гинса).
Протравы - химические и физические вещества, повышающие окрашиваемость микроорганизмов. Уплотняют цитоплазму и делают
окраску более прочной, либо разрыхляют клеточную стенку и способствуют проникновению краски в клетку (раствор Люголя в методе Грама, карболовая кислота в методе Циля-Нильсена)
Дифференцирующие вещества - вещества избирательно обесцвечивают одни виды или структуры бактериальных клеток и не обесцвечивают другие (спирт в методе Грама, серная кислота в методе Циля-Нильсена и Ожешко).
Метод Циля-Нильсона:
|
цель метода |
Выявление кислотоустойчивых и некислотоустойчивых бактерий |
|
основной краситель |
карболовый раствор фуксина |
|
протрава |
карболовая кислота (в момент окрашивания) |
|
дифференцирующее вещество |
серная кислота |
|
дополнительный краситель |
водный раствор метиленового синего |
|
способ фиксации препарата-мазка |
в пламени спиртовки в процессе окраски |
|
этапы окраски |
Окрашивать карболовым раствором фуксина (фуксин Циля) через фильтровальную бумажку при осторожном нагревании над пламенем спиртовки 3 раза до появления паров белого цвета (1); Промыть в 5% серной кислоте; Промыть водой; Окрасить раствором метиленового синего 1 мин.; Промыть водой; Высушить |
|
сущность метода |
При частичном гидролизе клеточной стенки фуксин взаимодействует с миколовыми кислотами и образует комплекс в присутствии фенола. Фенол разрыхляет бактериальную оболочку и краска проникает внутрь клетки. Кислотоустойчивые -красные, некислотоустойчивые - синие |
Практическое применение : для диагностики заболеваний (туберкулез)
Вопрос 7. Клеточная стенка бактерий: особенности строения у грамположительных и грамотрицательных бактерий, функции, методы выявления. Особенности строения клеточной стенки кислотоустойчивых бактерий. L -формы бактерий.
Ответ:
Клеточная стенка. Располагается над ЦПМ.
КС обеспечивает постоянную форму клетки, механическую и осмотическую защиту, взаимосвязь с окружающей средой, несет рецепторы для бактериофагов.
Отдельные соединения в составе КС обладают целым спектром иммунобиологических свойств : участвуют в адгезии, угнетении фагоцитоза, обладают иммуномодулирующей активностью и т.д.
Химический состав и строение клеточной стенки постоянны и являются важным таксономическим признаком.
В зависимости от строения клеточной стенки прокариоты, относящиеся к эубактериям, делятся на две большие группы: грамположительные и грамотрицательные бактерии.
Основа -пептидогликан , обеспечивающий ригидность и эластичность КС.
Структура: N-ацетилглюкозамина и N-ацетилмурамовой кислоты, соединенных между собой посредством гликозидных связей.
К каждому остатку N-ацетилмурамовой кислоты присоединен короткий пептид из 4-5 аминокислот.
Две особенности пептидного хвоста заслуживают внимания: наличие аминокислот в D-форме (неприродная конфигурация) и высокое содержание аминокислот с двумя аминогруппами. Это имеет принципиальное значение для пространственной организации пептидогликана. Обе аминогруппы этих аминокислот могут участвовать в образовании пептидных связей.
У грамположительных эубактерий он составляет основную массу вещества клеточной стенки (от 40 до 90%), у грамотрицательных - содержание пептидогликана значительно меньше (1-10%).
Функции клеточной стенки:
Обусловливает форму клетки.
Защищает клетку от механических повреждений извне и выдерживает значительное внутреннее давление.
Обладает свойством полупроницаемости, поэтому через нее избирательно проникают из среды питательные вещества.
Несет на своей поверхности рецепторы для бактериофагов и различных химических веществ.
Особенности строения КС Гр+
Клеточная стенка грамположительных бактерий достаточно плотно прилегает к ЦПМ.
Пептидные сшивки в пептидогликане обеспечивают его трехмерную пространственную организацию.
Многослойный пептидогликан пронизывают тейхоевые кислоты – полифосфатные соединения на основе рибитола или глицерина.
Тейхоевые кислоты ковалентно могут соединяться с N-ацетилмурамовой кислотой (собственно тейхоевые или стеночные) или с гликолипидом ЦПМ (липотейхоевые).
Свободные гидроксилы фосфорной кислоты придают тейхоевой кислоте свойства полианиона, определяющего поверхностный заряд клетки.
Особенности строения КС Гр-
Пептидогликан образует только тонкий внутренний слой клеточной стенки, неплотно прилегающий к ЦПМ.
У большинства видов пептидогликан образует одно- или двухслойную структуру, характеризующуюся весьма редкими поперечными связями между гетерополимерными цепями.
Снаружи от пептидогликана располагается дополнительный слой клеточной стенки - наружная мембрана. Она состоит из фосфолипидов, типичных для элементарных мембран, белков, липопротеина и липополисахарида (ЛПС).
ЛПС сложного молекулярного строения, занимает около 30-40% поверхности наружной мембраны и является ее важнейшим компонентом.
Методом выявления клеточной стенки является метод Пешкова (КС –красная; цитоплазма –розовая), по Грамму-тип стоения клеточной стенки.
Метод выявления клеточной стенки: Метод Пешкова
Этапы окраски :
1.мазок протравливать в 10% растворе танина 6-8 мин
2.промыть водой
3.окрашивать водным раствором фуксина 30-60 сек
4.высушить
Сущность метода : танин уплотняет клеточную стенку бактерий, и большая часть фуксина задерживается в ней
Цель : выявление клеточной стенки. КС - красная, цитоплазма -розовая
Особенности клеточной стенки кислотоустойчивых бактерий
Клеточная стенка кислотоустойчивых бактерий содержит большое количество липидов и восков, делающих их устойчивыми к последующему после окрашивания обесцвечиванию кислотами, щелочами или этанолом (например, виды Mycobacterium или Nocardia). Для их окраски применяют метод Циля-Нильсена .
L-формы
Если бактерии частично или полностью утратили клеточную стенку, но сохранили способность к размножению, они называются L-формами.
L-формы бактерий образуются под воздействием препаратов, ингибирующих синтез пептидогликана (антибиотик пенициллин) или разрушающих пептидогликан (лизоцим).
Изучают L-формы в фазово-контрастном микроскопе
Воспрос 8. Капсула бактерий: химическая природа, строение, функции, значение. Методы выявления капсул. Примеры инкапсулированных бактерий.
Капсула бактерий располагается поверх клеточной стенки. Она защищает бактериальную клетку во внешней среде от механического повреждения, высыхания, ядовитых веществ, бактериофагов, фагоцитов(в инфицированном организме). Выявление: в мазках-отпечатках из органов зараженных животных(простой метод, метод Грама). Тела бактерий окрашены на фоне окрасившейся ткани органа,окружены белым ореолом капсулы(капсула не окрашивается). Метод Бурри-Гинса (для окраски чистой культуры капсульных бактерий).
Метод выявления капсул: метод Бурри-Гинса
Цель метода : выявление капсулы у бактерий
Этапы окраски :
1.в каплю туши добавить каплю жидкости с микроорганизмами и растереть тонким слоем как мазок крови
2.высушить и зафиксировать в пламени горелки
3.окрасить карболовым фуксином 1мин
4.высушить
Сущность метода : капсула не окрашивается, задерживает тушь на поверхности, а фуксин окрашивает бактериальную клетку
Пример инкапсулированных бактерий : Klebsiella pneumoniae , Bacillus cereus
Воспрос 9. Жгутики у бактерий: строение, типы расположения, функции, способы выявления. Ворсинки: фимбрии, пили, подразделение, строение, функции. Примеры бактерий.
Жгутики являются органами движениями, представляют собой нитевидные придатки,состоят из белка флагеллина; прикрепляется к бакт.клетке с помощью базального тельца(система дисков и крючка, к которому прикреплена жгутиковая нить). Монотрихи (один жгутик),перитрихи (жгутики по всей поверхности бакт клетки), лофотрихи (пучок жгутиков на одном конце клетки), амфитрихи (единичные жгутики или пучки на разных полюсах клетки). Способы выявления: метод серебрения(жгутики искусственно утолщаются и становятся видимыми в иммерсионном микроскопе); наличие жгутиков определяется по активной подвижности микробных клеток.
Ворсинки(фимбрии и пили) состоят из белка пилина, видны только в электронном микросопе(тонкие и короткие). F -пили (половые, обеспечивают конъюгацию междубактериями);фимбрии общего порядка (адгезия).
Примеры бактерий: Половые пили Е. соli
Salmonella Typhi - перитрихи
Vibrio cholerae - монотрихи
Campylobacter jejuni - лофотрихи или амфитрихи
Воспрос 10. Споры бактерий: типы расположения спор в клетке, строение споры. Причины устойчивости спор к воздействию факторов внешней среды. Методы выявления спор. Примеры спорообразующих бактерий.
Эндоспора- являются приспособлением бактерий для сохранения вида в неблагоприятных условиях внешней среды. В одной бактериальной клетке образуется только одна спора! Такой способностью обладают бактерии рода Bacillus и Clostridium . (Bacillus – центральное расположение спор, не превышают поперечник клетки; Clostridium-крупные споры, субтерминально/терминально,в месте нахождения споры клетка раздувается, приобретая веретенообразную форму).Высокая резистентность ,причины: низкое содержание свободной воды, высокое содержание кальция,наличие дипиколиновой кислоты и белка, богатого цистеином,наличие нескольких оболочек). Окрашивание спор-метод Ожешки.(на высушенный мазок наложить фильтовальную бумажку, налить 0,5% раствор соляной кислоты и нагревать над пламенем спиртовки до появления пара 3 раза;далее окрашивать по Цилю- Нильсену.(Вегетативные клетки в готовом мазке-голубого цвета,споры-рубиново-красные).
Воспрос 11. Ультраструктура бактериальной клетки. Строение цитоплазматической мембраны, функции, методы выявления. Особенности строения наружной мембраны грамотрицательных бактерий.
ЦМП-основной барьер,который ограничивает протопласт бактерий,выявляется только в электронном микроскопе;состоит из двойного слоя фосфолипидов,куда включены интегральные и неинтегральные белки;от мембраны эукариот отличается отсутствием стеролов.
Функции : участвует в процессах избирательного активного транспорта молекул из внешней среды, является осмотическим барьером и осмотическим мостиком, выделяет гидролитические ферменты, в ее состав входят ферменты электрнонно-транспортной цепи,с ней связана АТФ-аза, содержит ферменты комплекса репликации ДНК нуклеоида,в ней фиксируются жгутики и ворсинки,имеет ферментный аппарат,участвующий в синтезе своих собственных структур, клеточной стенки.
Мезосомы - инвагинации ЦПМ внутрь клетки. Играют роль в репликации хромосомы и ее последующем расхождении по дочерним клеткам, разграничивает внутреннее содержимое на отсеки. Мезосомы грамотрицательных бактерий-простые инвагинации, грамположительных имеют сложную морфологию (везикулярные,трубчатые,пластинчатые).
Наружная мембрана грамотрицательных бактерий связана посредством липопротеина с подлежащим тонким слоем пептидогликана; внутренний компонент-фосфолипидный бислой, в наружном расположен липополисахарид (является О-антигеном, состоит из: липида А-консервативная структура; ядра, или стержневой, коровой части-олигосахаридная структура; высоковариабельного О-специфического олигосахарида). Белки- порины пронизывают мембрану, образуя гидрофильные поры, также являются рецепторами для бактериофагов.(из учебника)
Воспрос 12. Ультраструктура бактериальной клетки. Рибосомы: строение рибосом у прокариот, функции. Отличия в строении рибосом эукариотических клеток. Цитоплазматические включения у бактерий: химическая природа, функции, способы выявления, значение.
Рибосомы прокариот имеют константу седиментации 70 S. Они построены из двух частиц: 30 S (малая субъединица) и 50 S (большая субъединица). S - это коэффициент седиментации, который характеризует скорость перемещения молекул или частиц в центробежном поле при центрифугировании. Рибосомы рассеяны по всей цитоплазме
В клетке эукариот имеют 80S рибосомы прикреплены к эндоплазматическому ретикулуму. Функция: синтез белков
Включения- зерна волютина,содержащие поли- и мета-фосфаты. (Corynebacterium diphtheria). Окрашиваются простым методом Леффлера(окраска фиксированного в пламени горелки мазка щелочным мителеновым синим 5 мин. Тела бактерий-голубые,зерна волютина- темно-синие ) и сложным методом Нейссера (фиксированный в пламени горелки мазок окрашивают уксусно-кислой синькой в течении 1 минуты,промывают водой,протравливают раствором Люголя 30 скекунд и докрашивают везувином. Препарат промывают водой, высушивают, микроскопируют. Тела бактерий-желтые , зерна волютина- темно-синий цвет , расположены на обоих концах клетки) .
Воспрос 13. Ультраструктура бактериальной клетки. Нуклеоид бактерий: строение, функции и методы выявления. Особенности организации генетического аппарата прокариот и эукариот.
Нуклеоид у прокариот - генетический аппарат бактерий не имеет ядерной оболочки и представлен одной кольцевой двунитевой суперспирализованной молекулой ДНК,которая является хромосомой; располагается в цитоплазме,не содержит белков гистонов. Не способен к митозу
Генетический аппарат всех эукариот находится в ядре и защищён ядерной оболочкой.ДНК эукариот линейная. Хромосомы как структуры. Содержит белки-гистоны. Способен к митозу
Выявляют при электронной микроскопии, Романовского- Гимзы.
метод Романовского-Гимзы
Цель метода : выявление нуклеоида; нуклеоид - сине-фиолетовый; цитоплазма - розовая
Сущность метода : Амур и метиленовый синий окрашивает участки клетки со слабощелочным pH , эозин с кислым
Этапы окраски :
1.провести кислотный гидролиз в растворе соляной кислоты при нагревании
2.промыть водой
3.окрашивать краской Романовского-Гимзы 40-60 мин
4.высушить
14. Актиномицеты : морфология чистой культуры и структура друзы актиномицетов. Методы изучения. Роль в инфекционной патологии человека.
Актиномицеты - группа нитчатых грамположительных прокариот. Виды актиномицет представляют собой тонкие неспорообразующие полиморфные палочки и нити(гифы) с ветвлением; гифы переплетаясь, образуют мицелий.
Актиномицет у здорового человека обитают в полости рта и кишечном тракте, не причиняя ему вреда, но снижение иммунитета организма может вызвать заболевание - актиномикоз (развиваются гнойные хронические процессы с поражением любых органов и тканей).
В пораженном организме актиномицеты образуют друзы , имеющие звездчатую, лучистую форму. Центр друзы состоит из компактного кальцинированного плотного мицелия, а периферийные гифы покрыты капсулоподобными эозинофильными чехлами, выполняющими защитную функцию.
Для изучения актиномицет применяют методы Грама и Циля-Нильсена
15. Микоплазмы : таксономия, строение клетки, особенности морфологии, биологические свойства, методы культивирования и выявления. Роль в инфекционной патологии человека.
Ответ : Класс - Mollicutes
Порядок - Mycoplasmatales
Семейство - Mycoplasmataceae
Род - Mycoplasma
Микоплазмы - полиморфные микроорганизмы, отличающиеся от других прокариотов отсутствием клеточной стенки
Поверхностной оболочкой микоплазм является цитоплазматическая мембрана, более прочная и эластичная (т.к. в ней присутствует холестерин). Клетки микоплазм содержат нуклеоид(самый маленький), рибосомы, цитоплазму и цпм (без мезосом). У некоторых микоплазм обнаружены микроворсинки (Mycoplasma pneumoniae) и нитчатые выросты различной длины, которые принимают участие в скользящем движении клеток и адгезии.
Для культивирования микоплазм используют специальные полужидкие среды , на которых через 2-4 недели получают видимый рост в виде колоний, напоминающий "яичницу- глазунью"(из-за хрупкости микоплазм - т.к. Отсутствует клеточная стенка).Их изучают в нативных препаратах в фазово-контрастном микроскопе (не удается окрасить из-за хрупкости)
16. Риккетсии : таксономия, биологические свойства, морфологические формы, методы окраски, методы культивирования. Жизненный цикл риккетсий. Роль риккетсий в патологии человека (назовите заболевания и соответствующих им возбудителей).
Ответ : Царство - Bacteria
Порядок - Rickettsiales
Семейство - Rickettsiaceae
Род - Rickettsia
Риккетсии - грамотрицательные полиморфные бактериоподобные прокариоты,капсул,спор не образуют. Облигатные внутриклеточные бактерии, которые не растут на простых питательных средах. Жизненный цикл риккетсий включет 2 стадии - вегетативную и покоящуюся . В вегетативной стадии риккетсии активно размножаются путем бинарного деления; покоящаяся форма обладает повышенной резистентностью(меньших размеров, с утолщенной клеточной стенкой).
Различают 4 морфологические формы риккетсий (по Здродовскому ) :
Кокковидную (d= 0,3-0,4мкм)
Палочкивидную (1-2 мкм)
Бациллярную(3-5 мкм)
Нитевидную(до 40 мкм)
Риккетсии культивируются в желточных мешках куриных эмбрионов, перевиваемых культурах клеток, легких белых мышей. Риккетсии можно культивировать путем инфицирования ими переносчиков возбудителей инфекций - вшей, блох, клещей. Для окраски риккетсий применяют сложные методы - Романовского-Гимзы и Здродовкого
Методика окраски :
1.фиксированный в пламени горелки мазок окрашивают разведенным карболовым фуксином Циля(без нагревания)
2.промывают водой
3.обесцвечивают слабым раствором органической 0,5% лимонной к-ты, 0,15% уксусной к-ты или минеральной кислоты (0,01% HCL)
4.промывают водой и докрашивают водным раствором метиленового синего
Результат окраски : риккетсии - в рубиново-красный; цитоплазма - голубая; ядро - синее
Патогенные для человека риккетсии являются возбудители риккетсиозов, для которых характерны сыпнотифозные или пятнистые лихорадки. Например, Rickettsia prowazekii вызывает эпидемический вшивый сыпной тиф.
17. Хламидии : таксономия, морфология и ультраструктура, жизненный цикл. Методы выявления и культивирования. Роль в инфекционной патологии человека.
Ответ : Семейство - Chlamydiaceae
Род - Chlamydia
ЭТ - внеклеточная инфекционная частица (0,2-0,4 мкм), содержит компактный нуклеоид, рибосомы, жесткую клеточную стенку. ЭТ проникает в чувствительную клетку путем эндоцитоза, вокруг него образуется вакуоль. Внутри вакуоли ЭТ разбухает, приобретает сетчатую структуру, увеличивается до 0,5-1,5 мкм и превращается в РТ.
РТ внутри вакуоли многократно делится путем образование поперечных перегородок. Вакуоль заполняется микро-колониями хламидий, содержащих большое количество РТ в процессе деления, промежуточные тельца и ЭТ. Вакуоль превращается во внутриклеточное включение, покрытое оболочкой - хламидой, расположенное в цитоплазме клетки-хозяина. Выход хламидий из клетки - через неповрежденную мембрану или при гибели клетки. Освободившиеся ЭТ внедряются в другие здоровые клетки, где цикл развития повторяется.
Изучают хламидии в живом состоянии, в фазово-контрастном микроскопе и окрашивают методом Романовского-Гимзы (ЭТ - розовые, РТ - сине-голубые).
Патогенны: Chlamydia trachomatis (трахома и урогенитальные инфекции), Chlamydia pneumoniae (респираторные инфекции), Chlamydia psittaci (орнитоз).
18. Спирохеты : таксономия, биологические свойства, ультраструктура клетки, цисты. Методы изучения спирохет нативных и окрашенных препаратов. Роль спирохет в инфекционной патологии человека.
Семейство – Spirochaetaceae
Спирохеты - тонкие нитевидные, спирально извитые микроорганизмы, обладающие активной подвижностью. Относятся к грамотрицательным прокариотам. Клеточная стенка эластичная, что позволяет им совершать колебательные, вращательные и сгибательные движения.
Двигательный аппарат представляет собой фибриллярный тяж, состоящий из 2х пучков фибрилл, расположенных субтерминально на обоих концах клетки. Фибриллы пролегают в клеточной стенке, обвивая цитоплазматический цилиндр (протопласт). В середине клетки фибриллы перекрывают друг друга. Фибриллы состоят из белка флагеллина.
Спирохеты изучают в нативных препаратах, используя темно-польную микроскопию для выявления их форм и подвижности. Их Ультраструктуру изучают с помощью электронной микроскопии. Для изучения спирохет в окрашенном состоянии применяют: метод Романовского-Гимзы (боррелии в сине-фиолетовый, трепонемы в бледно-розовый, лептоспиры в красно-розовый), метод серебрения по Морозову (спирохеты имеют вид тесно-коричневых спиралей на светло-желтом фоне препарате),негативный способ Бурри (тушь не проникает тела микробов,на темном фоне белые контуры спирохет)
существенную роль в инфекционной патологии человека играют роды Treponema, Borrelia и Leptospira. Treponema pallidum - возбудитель сифилиса, Borrelia recurrentis - возбудитель возвратного тифа, Leptospira interrogans является возбудителем лептоспироза
19. Микроскопические грибы : морфология, ультраструктура. Размножение плесневых и дрожжевых грибов. Методы изучения. Роль в инфекционной патологии человека.
Протопласты (содержимое клетки, заключенное в клеточную стенку) клетки грибов содержат ядро с ядрышком, митохондрии, лизосомы, эндоплазматический ретикулум, рибосомы, фагосомы, вакуоли и др. Снаружи протопласты покрыты ЦПМ с высоким содержанием стеролов (главным образом эргостерола) и плотной клеточной стенкой,в состав которой входят хитин, целлюлоза, глюкуроновая кислота, глюканы, различные углеводы, липиды, белки, пигменты.
По морфологическим особенностям грибы подразделяются на группы: плесневые грибы и дрожжеподобные грибы
Плесневые грибы образуют мицелий (тело гриба), который состоит из переплетенных гифов. На питательной среде плесневые грибы образуют субстратный мицелий, который прорастает в нее, извлекая из среды все необходимые для роста и размножения вещества, и воздушный мицелий,на котором созревают неполовые споры,с помощью которых грибы размножаются. Бесполовой путь у плесневых грибов характеризуется образованием большого количества экзоспор или эндоспор. Многие грибы могут размножаться и половыми спорами(половым путем).
Дрожжевые грибы размножаются почкованием.
Морфологию грибов изучают в нативных препаратах "раздавленная капля" в затемненном поле зрения, фазово-контрастном и люминесцентном микроскопе и с помощью окраски простым методом, по Граму, Цилю-Нильсену,Нейссеру
Заболевания вызываемые микроскопическими грибами - микозы.Грибковое заболевание Кандидоз - вызывается Candida albicans
РАЗДЕЛ ФИЗИОЛОГИЯ.
Окраска мазков по методу Грамма Наиболее распространенный метод окраски бактерий, позволяющий отнести клетки по типу окраски стенки к грациликутам (грамотрицательным) или фирмикутам (грамположительным).
На фиксированный мазок накладывают кусочек фильтровальной бумаги, на него наливают карболовый раствор генцианвиолета на 30-50 секунд. Сливают краситель, удаляют бумажку, наносят раствор Люголя на 60 секунд. Сливают раствор Люголя. Споласкивают препарат в 95° этаноле 30-50 секунд, пока не перестанет отходить краситель, что зависит от толщины мазка. Промывают препарат водой, докрашивают 30-60 секунд фуксином Пфейффера, промывают водой, подсушивают и микроскопируют. Микроскопическая картина: грамположительные бактерии - фиолетового, грамотрицательные - красного цвета.
Практика показывает, что более чистые препараты без ущерба для дифференциации получаются, если после окраски генцианвиолетом мазок слегка споласкивают водой, остатки которой стряхивают и только потом наносят раствор Люголя.
Модификация по А.П. Синеву. На фиксированный мазок кладут полоску бумаги с красителем, наливают 2-3 капли воды и окрашивают 2 минуты. Далее поступают как описано выше.
Модификация по Керри. Мазок окрашивают 1-2 минуты спиртовым раствором генцианвиолета, обрабатывают 1-2 минуты раствором йода, затем 30-40 секунд этанолом. Промывают. Повторно обрабатывают 1 минуту раствором йода, промывают, докрашивают 1-2 минуты фуксином или смесью сафранина с бриллиантовой зеленью.
Модификация Берка. Раствор А: 1%-ный раствор кристаллвиолета в дистиллированной воде.
Протрава: йод кристаллический – 1 г, йодистый калий - 2 г, дистиллированная вода – 100 мл.
Растворитель для обесцвечивания: этиловый эфир – 1 объем, ацетон – 3 объема.
Дополнительный краситель: 2%-ный раствор сафранина в дистиллированной воде.
Методика. Фиксированный нагреванием мазок погружают в раствор А, Мазок ополаскивают в йодной протраве и покрывают его свежей протравой на 2 мин. Промывают водой, а затем растворителем для обесцвечивания до тех пор, пока стекающий растворитель не будет содержать краски. После подсушивания окрашивают дополнительными красителем 5-10 сек, промывают водой, микроскопируют.
Модификация Хукера
Раствор А: кристаллвиолет – 2 г, 95%-ный этанол - 20 мл.
Раствор Б: щавелевокислый аммоний – 0,8 г, дистиллированная вода - 80 мл.
Раствор А и Б в приготовленных объемах смешивают в темном флаконе и оставляют при комнатной температуре на 24 ч.
Раствор В: 2,5%-ный раствор сафранина (в 96%-ном этаноле) – 10 мл, дистиллированная вода - 100 мл.
Методика. Фиксированный нагреванием мазок погружают в смесь растворов А и Б на 1 мин, после чего препарат промывают водой и обрабатывают раствором Люголя 1 мин, затем вновь промывают водой и подсушивают; наносят 96%-ный этанол на 30 с, препарат тщательно промывают водой, подсушивают, помещают в раствор В на 10 секунд, слегка промывают водой, подсушивают, микроскопируют.
Тест с гидроксидом калия для контроля результатов окраски бактерий по Граму. Если окраска по Граму нечеткая, этот метод позволяет уточнить полученный результат.
Постановка теста. На предметное стекло наносят 1-2 капли 3%-ного раствора КОН. Агаровую культуру бактериологической петлей вносят в КОН, перемешивают и затем поднимают петлю вверх. Если культура в виде «нити» тянется за петлей - грамотрицательная, при отсутствии этого феномена - грамположительная бактерия.
Методы окраски кислотоустойчивых бактерий
Окраска по Циль-Нильсену. Готовят карболфуксиновый краситель: основной фуксин – 0,3 г, 95%-ный этанол - 10 мл, фенол (кристаллы, расплавленные при нагревании) - 5 мл, дистиллированная вода – 95 мл.
Основной фуксин растворяют в этаноле, добавляют растворенный в воде фенол, перемешивают, выдерживают 5-7 дней при комнатной температуре; перед использованием фильтруют через фильтровальную бумагу.
Растворитель для обесцвечивания (солянокислый спирт): этанол 95%-ный - 97 мл, соляная кислота концентрированная - 3 мл. Дополнительный краситель: метиленовый синий - 0,3 г, дистиллированная вода -100 мл.
Методика. На фиксированный нагреванием мазок наливают карбол-фуксиновый краситель, подогревают до отхождения паров (но не кипятить!). Через 5 минут промывают водой. Затем мазок обрабатывают 30-50 сек растворителем для обесцвечивания, промывают водой, после чего пленка бактерий на мазке становится бледно-розовой.
Мазок докрашивают 3-5 минут дополнительным красителем (метиленовый синий и т.д.), промывают водой, высушивают.
Кислотоустойчивые микроорганизмы в мазке красного цвета, другие - синего.
Окраска аурамином. Раствор А: аурамин - 1,5 г, родамин В - 0,75 г, глицерин - 75 мл, фенол расплавленный - 10 мл, вода дистиллированная - 50 мл.
Красители: фенол и глицерин растворяют в 25-30 мл воды, добавляют оставшийся объем воды и фильтруют через стекловату.
Раствор Б: 70%-ный этанол - 99,5 мл, кислота соляная концентрированная - 0,5 мл.
Раствор В: калий марганцевокислый - 0,5 г, вода дистиллированная - 99,5 мл.
Методика. Фиксированный над пламенем горелки мазок 15 мин окрашивают раствором А при комнатной температуре или при 37-38° С. Промывают под струей воды до обесцвечивания. Наливают на мазок на 3-5 мин раствор Б, промывают и докрашивают еще 2-4 мин раствором В. Промывают, высушивают, микроскопируют в люминесцентном микроскопе под иммерсией (возбуждающий светофильтр ВG-12, запирающий ОG-1).
Кислотоустойчивые бактерии желто-оранжевого цвета на темном фоне.
Окраска по Муху. Препарат выдерживает 24 часа в растворе метилвиолета (10 мл насыщенного спиртового раствора метилвиолета, 100 мл 2%-ного водного раствора карболовой кислоты). На 1-2 минуты наносят раствор Люголя, далее на 1 мин 5%-ный раствор азотной кислоты и 10 секунд 3%-ный раствор соляной кислоты. Затем на препарат до прекращения отхождения краски наносят смесь этанола и ацетона (1:1), промывают водой, высушивают и микроскопируют.
Методы окраски спор
Метод Ауески. Высушенный на воздухе мазок без фиксации обрабатывают 2-3 мин (при подогревании) 0,5%-ной серной кислотой, промывают и фиксируют над пламенем. Окрашивают в течение 7-8 мин карболовым фуксином Циля при подогревании, краску сливают. Мазок обрабатывают 5-7 секунд 5%-ным раствором серной кислоты, промывают и докрашивают 4-5 мин метиленовой синью. При микроскопии вегетативная часть клетки синего, спора - красного цвета.
Метод Меллера. Фиксированный над пламенем мазок протравливают 2-3 мин 5%-ной хромовой кислотой, промывают, окрашивают карболовым фуксином Циля. Обесцвечивают и окрашивают также, как и по методу Ауески.
Метод Пешкова. Фиксированный мазок окрашивают метиленовой синью с подогревом до закипания. Краску смывают и докрашивают 1%-ным водным раствором нейтральрота в течение 10 секунд. Промывают, высушивают. Споры синие, вегетативные клетки - красные.
Метод Шеффера-Фултона. На фиксированный нагреванием мазок, покрытый фильтровальной бумагой, наливают 0,5%-ный водный раствор малахитовой зелени. Мазок помещают на 5 мин над кипящей водой. Промывают и докрашивают 30 сек 2%-ным водным раствором сафранина. Промывают, высушивают. Споры ярко-зеленого цвета, вегетативные клетки - красно-коричневого.
Метод Трухильо. Мазок фиксируют над пламенем горелки, покрывают насыщенным водным раствором малахитовой зелени, подогревают до появления пара и окрашивают 3 минуты. Краску смывают водой и докрашивают мазок 0,25%-ным водным раствором основного фуксина в течение 1 мин. Промывают, высушивают. Споры зеленого цвета, вегетативные клетки - красного.
Метод Дорнера. Фиксированный на пламени горелки мазок окрашивают в течение 5-10 мин карболовым фуксином при подогревании, 1 мин обесцвечивают солянокислым спиртом (3 мл концентрированной соляной кислоты и 97 мл 96%-ного этанола). Препарат промывают, высушивают фильтровальной бумагой и наливают на мазок тонким слоем 10%-ный раствор нигрозина в 0,5%-ном растворе формалина. Не промывая, мазок высушивают на воздухе и микроскопируют. Споры - красные, вегетативные клетки - бесцветные на черном фоне.
Метод Валъдмана. На фиксированный препарат наносят синьку Леф-лера (щелочную) и нагревают до кипения, затем охлаждают и промывают водой. Докрашивают 1%-ным раствором нейтральрот в течение 30 секунд. Микроскопическая картина: споры - синие, вегетативные клетки - красные.
Метод Ожешки. На нефиксированный мазок наливают 0,5%-ный раствор НС1 и подогревают 1-2 минуты. Сливают кислоту, промывают препарат водой, подсушивают, фиксируют на пламени и окрашивают по методу Циль-Нильсена. Микроскопическая картина: споры – красного, вегитативные клетки – синего цвета.
Методы окраски капсул
Способ Романовского-Гимза. Фиксированный в этаноле или жидкости Никифорова мазок помещают в краску Романовского-Гимза (15-20 капель краски на 10 мл дистиллированной воды) на 15-20 мин. Промывают, высушивают. Тело бактерий окрашивается в темно-синий цвет, капсулы - в розовый.
Способ Ольта. Фиксированные мазки над пламенем горелки окрашивают 1-3 мин 2%-ным водным раствором сафранина (сафранин растворяют в горячей воде, фильтруют, применяют свежеприготовленный раствор). Тело бактерий окрашивается в коричневый цвет, капсула - в бледно-желтый.
Способ Ребигера. Нефиксированный мазок окрашивают в течение 15-20 сек раствором генцианвиолета в формалине (15-20 г генцианвиолета растворяют в 100 мл 40%-ного формалина, отстаивают, фильтруют), промывают водой. Тело бактерий - темно-фиолетового цвета, капсула - красновато-фиолетового.
Способ Антоны. Мазок окрашивают 2 мин 1%-ным водным раствором кристаллвиолета. Краску смывают 20%-ным водным раствором сульфата меди (СuSO 4 ·5Н 2 О), избыток раствора стряхивают и мазок, не промывая водой, высушивают фильтровальной бумагой. Микробы - темно-фиолетовые, капсула - светло-голубая.
Способ Гинса. На предметное стекло наносят каплю черной туши, раз-веденной 1:3 дистиллированной водой и центрифугируют при 3000 об/мин 15 мин. В капле туши суспензируют петлей культуру и делают мазок (подобно мазку крови). Высушивают, фиксируют над пламенем горелки, окрашивают карболфуксином Циля, разведенным 1:3. Тела бактерий - красные. Капсула на темном фоне видна в виде светлого ореола вокруг бактерий.
Способ Михина. Мазок окрашивают в течение 3-5 мин синькой Леф-флера (пригодна только краска, хранившаяся не менее 20-30 дней, т.к. при хранении в ней образуется азур, придающий метахроматичность). Тела бактерий - синие, капсула - розовая.
Способ Гисса. На предметное стекло наносят каплю нормальной сыворотки крови крупного рогатого скота или лошади (или каплю обезжиренного молока), петлей вносят в нее культуру, суспензируют и готовят мазок. Высушивают пленку бактериальной суспензии на воздухе, фиксируют над пламенем горелки и окрашивают при подогревании в течение 1 мин 0,1%-ным водным кристаллвиолета. Мазок промывают 20%-ным водным раствором сульфата меди, высушивают фильтровальной бумагой. Капсулы в мазке - бледно-голубого, тела бактерий - темно-фиолетового цвета.
Способ Дюгида. На предметное стекло помещают каплю черной туши, суспензируют в ней культуру. Каплю покрывают покровным стеклом, фильтровальной бумагой удаляют излишки туши. На коричнево-черном фоне видны преломляющие свет бактерии, окруженные капсулой в виде прозрачной зоны.
Способ Ионе. На один конец поверхности предметного стекла наносят каплю туши, разведенной 1:2-1:4 дистиллированной водой. В капле суспензируют бактерии и готовят мазок (как мазок из крови). Препарат высушивают на воздухе, фиксируют над пламенем горелки и окрашивают 2 мин 2%-ным водным раствором генцианвиолета или 1%-ным раствором фуксина. Промывают водой, обрабатывают 8-10 секунд 2%-ным раствором уксусной кислоты и вновь промывают. В мазке вокруг интенсивно окрашенных бактерий видна неокрашенная капсула.
Метод окраски жгутиков
О наличии жгутиков у бактерий судят по косвенным признакам, например по подвижности клеток в препаратах «раздавленная капля», «висячая капля», а также по характеру роста испытуемой культуры в полужидком агаре (0,15-0,3%). В последнем случае испытуемую культуру засевают уколом в ПЖА и инкубируют в течение 18-24 часов. В процессе роста подвижные бактерии мигрируют от линии укола, вызывая помутнение среды, неподвижные растут только по уколу.
В отдельных случаях применят методы окраски, позволяющие наблюдать непосредственно жгутикию
При всех методах окраски следует готовить препараты из молодых агаровых культур (14-20-часового роста). В пробирки с культурой на скошенном агаре на 30-40 мин добавляют 0,5%-ный водный раствор пептона. Жидкость отстаивают, для осаждения перешедших в нее микробов, центрифугируют. Осадок заливают физиологическим раствором и центрифугируют повторно. С целью предотвращения потери жгутиков отмытый осадок ресуспензируют в 10%-ном растворе формалина для получения слегка мутной суспензии.
Окраска жгутиков осмиевой кислотой. На чистом обезжиренном предметном или часовом стекле смешивают каплю суспензии бактерий с каплей 2%-ного раствора осмиевой кислоты. Полученную каплю смеси тонким капилляром пастеровской пипетки наносят на чистое обезжиренное предметное стекло. Высушивают на воздухе и фиксируют на пламени (избегать перегревания!).
На фиксированный препарат наливают протраву, приготовленную за несколько суток (1 мл насыщенного спиртового раствора фуксина, 10 мл 20%-ного водного раствора танина и 5,5 мл насыщенного водного раствора сернокислого аммиака железа). Через 15 мин протраву смывают водой, докрашивают 4 мин фуксином, промывают и микроскопируют.
Окраска жгутиков серебрением. Из суспензии готовят тонкий мазок, высушивают и фиксируют в течение 2-3 минут 2%-ным раствором осмиевой кислоты. Промывают препарат, погружением на 2-3 с в 0,5%-ный водный раствор азотнокислого серебра и, не промывая, опускают на 2-3 с в протраву (пирогаллол или галловая кислота - 2,0 г, танин – 1,2 г, натрий уксуснокислый – 4,0 г, вода дистиллированная - 150 мл). Вынимают из протравы и снова погружают в раствор азотнокислого серебра, выдерживая до тех пор, пока препарат не почернеет. После промывки проводят микроскопию.
Окраска жгутиков по Плиммеру. Готовят краску: танин - 5,0 г, цинк хлористый - 5,0 г, алюминий хлористый - 10,0 г, фуксин в порошке – 0,75 г навески перечисленных компонентов растирают в ступке, постепенно порциями добавляя 40 мл 60%-ного этанола до их полного растворения. Перед употреблением краску разводят водой (1:5).
На высушенный тонкий мазок кладут полоску фильтровальной бумаги и заливают приготовленной краской. Через 2 мин краску смывают водой и дополнительно окрашивают карболовым фуксином Циля. Бактерии и жгутики - красного цвета.
Окраска жгутиков по Беничетти. Заранее готовят 3 раствора. Раствор 1: цинк сернокислый - 0,5 г, танин - 8,0 г, вода дистиллированная - 50 мл. Раствор 2: насыщенный раствор алюмокалиевых квасцов. Раствор 3: насыщенный раствор генцианвиолета или кристаллвиолета. Перед употреблением растворы смешивают (5:5:3). На высушенный мазок наливают смесь растворов и нагревают до появления пара. Через 3 мин промывают и микроскопируют. Жгутики фиолетово-черного цвета.
Окраска по Валенти. Мазок обрабатывают 3 мин 20%-ным раствором танина при подогревании, промывают, окрашивают 10 мин карболовым фуксином при подогревании. Промывают, микроскопируют. Бактерии и жгутики - красного цвета.
Окраска по Грэю. Раствор А: дубильная 20%-ная водная кислота - 2 мл, насыщенный водный раствор калийных квасцов - 5 мл, хлористая ртуть, насыщенный водный раствор - 2 мл, основной фуксин 3%-ный в 96%-ном этаноле - 0,4 мл. Краситель (фуксин) добавляют к остальным ингредиентам непосредственно перед употреблением и после его растворения полученный раствор фильтруют через фильтровальную бумагу. Раствор Б: карболовый фуксин Циля (основной фуксин 3%-ный на 95%-ном этаноле - 10 мл, фенол - 5 мл, дистиллированная вода - 95 мл).
Методика. Каплю бактерий (суспензию) в формалине наносят на стекло и дают ей стечь. Высушивают на воздухе. Кладут полоску фильтровальной бумаги и на 4-6 мин наливают раствор А. Промывают водой и 3 мин окрашивают через фильтровальную бумагу раствором Б. Промывают, высушивают, микроскопируют. Жгутики и бактерии - красного цвета.
Окраска по Ляйфсону. Готовят 3 раствора. Раствор 1: 1,5%-ный раствор хлористого натрия в дистиллированной воде. Раствор 2: 3%-ный раствор дубильной кислоты в дистиллированной воде. Раствор 3: уксуснокислый розанилин - 0,9 г, солянокислый прозанилин – 0,3 г, 96%-ный этанол - 100 мл. Смешивают поровну растворы 1 и 2 и затем 2 объема этой смеси приливают к 1 объему раствора 3. Смесь сохраняется в холодильнике до 3 месяцев.
Методика. Каплю суспензии наносят на хорошо обезжиренное стекло и дают ей стечь. Высушив, очерчивают карандашом по стеклу границы пленки бактерий, на 7-15 мин площадку заливают красителем. Выдерживают до тех пор, пока поверхность красителя приобретет золотистый цвет, а пленка бактерии не будет покрыта осадком. Промывают, высушивают. Бактерии и жгутики – красного цвета.
Методы окраски клеточной стенки
Окраска клеточной стенки имеет диагностическую ценность при дифференциации микоплазм от бактерий.
Метод Гутштейна. Препарат фиксируют 1-2 часа в жидкости Буэна, выдерживают 2-3 минуты в 5-10%-ном водном растворе танина, ополаскивают водой и микроскопируют в капле 0,01%-ного водного раствора кристаллического фиолетового.
Метод Пешкова. Препарат фиксируют 15 минут в жидкости следующего состава: этанол 90%-ный – 60 мл, хлороформ - 30 мл, уксусная эссенция – 10 мл. Далее препарат выдерживают в течение 2-5 минут в 10%-ном водном растворе танина, промывают водой, красят 30-60 секунд фуксином Пфейффера и, не перемешивая, подсушивают и микроскопируют.
Метод) Робиноу. Исследуемый микроорганизм выращивают на агаровой среде в чашке Петри, вырезают агаровый блок и кладут его поверхностью на покровное стекло, помещают на ночь в жидкость Буэна. На следующий день удаляют агар, стекло отпечатком вниз кладут на поверхность 5-10%-ното водного раствора таниновой кислоты на 20-30 минут. Затем препарат промывают водой, покровное стекло клетками бактерий вниз кладут на поверхность 0,02%-ного водного раствора кристаллического фиолетового на 5-10 секунд. В итоге клеточные оболочки и перегородки окрашиваются в темно-синий или в черный цвет, а цитоплазма остается неокрашенной.
Методы окраски цитоплазматических включений
При идентификации микроорганизмов определенное значение имеют данные о наличии в клетках включений, отражающих тип и направленность конструктивного метаболизма. К цитоплазматическим включениям относят поли-бетта-оксимасляную кислоту, зерна метахроматина (волютина) и полисахариды.
Поли-бетта-оксимасляная кислота представляет собой полиэфир бетта-оксимасляной кислоты, который накапливается в цитоплазме клеток в виде округлых или овальных гранул размером 200-800 нм. Метахроматин - это полифосфаты, а полисахариды – глюканы, состоящие из D-глюкозы, размером до 200 нм. Перечисденные включения выполняют роль своеобразных запасов веществ клеток и могут быть обнаружены специальными методами окраски.
Обнаружение поли-бетта-оксимасляной кислоты
Фиксированный над пламенем горелки мазок окрашивают 5-15 мин 0,3%-ным раствором Судана черного В в этиленгликоле. Краску сливают и после высушивания на воздухе без промывания водой ополаскивают в ксилоле. Дав мазку высохнуть, опускают на 5-10 с в 0,5%-ный водный раствор сафранина. Промывают водой, высушивают и микроскопируют. Включения поли-бетта-оксимасляной кислоты видны на розовом фоне цитоплазмы в виде черно-синих образований.
Обнаружение метахроматина (волютина)
Метод Нейссера. Готовят 4 раствора. Раствор А: метиленовый синий - 0,1 г, этанол 95%-ный - 2 мл, уксусная кислота ледяная - 6 мл, вода дистиллированная- 100 мл. Раствор Б: кристаллвиолет- 1 г, этанол 95%-ный - 100 мл, вода дистиллированная - 300 мл. Раствор В йод кристаллический - 1 г, калий йодистый - 2,0 г, вода дистиллированная - 300 мл. Раствор Г: хризоидин - 1 г, вода дистиллированная- 300 мл (хризоидин растворяют в горячей воде). На фиксированный над пламенем горелки мазок на 1 мин наливают смесь раствора А и Б в соотношении 2:1 (смесь готовят перед окраской). Сливают краску, обрабатывают 1 мин раствором В (раствор Люголя) и промывают водой, высушивают, микроскопируют. Клетки бактерий светло-желтого, зерна волютина - темно-синего цвета.
Метод Раскиной. Готовят краску следующего состава: карболовый фуксин Циля - 4 мл, насыщенный спиртовой раствор метиленовой сини - 4 мл, кислота уксусная ледяная - 5 мл, этанол 96%-ный - 95 мл, вода дистиллированная -92 мл. На фиксированный над пламенем горелки мазок наливают краситель, нагревают над горелкой до сгорания спирта, промывают водой, высушивают и микроскопируют. Клетки бактерий окрашиваются в светло-красный цвет, зерна волютина - в черно-синий.
Обнаружение полисахаридов
Окраска реактивом Шиффа. Готовят 4 раствора. Раствор А (раствор периодата): 4%-ный раствор йодной кислоты - 20 мл, 0,2 М водный раствор ацетата натрия - 10 мл, 96%-ный этанол - 70 мл. Раствор чувствителен к свету, поэтому его следует хранить в темной склянке в темноте.
Загрузка...
